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医用硅橡胶的抗菌
浏览: 发布日期:2017-08-02
        由于具有一些固有特性,例如与人体组织的生物相容性,硅橡胶通常被用于医疗设备。虽然硅橡胶本身相对呈惰性,但在使用设备期间,有机营养物可能吸附到硅橡胶表面,并形成生物膜。许多含有硅橡胶的设备暴露于适合生物膜生长的恰当湿气、营养物、时间和温度条件,包括移植、导管、静脉注射连接器以及用于呼吸治疗的管道。随着接触时间的增加以及没有成功进行干预,产生微生物的生物膜会造成感染。
用于硅橡胶的抗菌剂
       将抗菌剂集成于医疗设备内部或表面是一种降低微生物聚积在医疗设备表面并形成生物膜的可行战略。经过抗菌剂处理的医疗设备多种多样,包括导管、鲁尔设备、气管导管以及伤口敷料。少数情况下,使用抗菌剂设备不仅已经显示可以杀灭设备表面的微生物,而且还可降低感染率。
银基硅橡胶抗菌剂
       抗菌剂处理的生物相容性是需要考虑的最重要问题之一。细胞毒性是最敏感的生物相容性试验;经过处理的设备或设备浓缩剂直接暴露于哺乳动物细胞培养的细菌。银基抗菌剂会在这些体外试验中引起一些细胞毒性效应,但是,在严格的研究和对组织、整个动物和人体开展的观察中,则展现出很少的生物相容性问题或者没有生物相容性问题。在提交医疗设备进行的评审中,美国食品和药品管理局(FDA)和其它管理机构检查整套数据,以确定设备是否生物相容。由于银基抗菌剂用于伤口处理和其它应用的历史较长,管理机构和保健提供商对银具有一定的熟悉程度,而这种熟悉程度对于其它抗菌剂可能是没有的。为此,银是目前为止用于抗菌医疗设备的最常见抗菌剂。
       在集成于聚合物、树脂或涂层之后,存在已经加工银释放银离子的几种不同配方。不管银技术是否基于银金属(AG0)、银盐(例如AgCl)或离子银(Ag+)或者银离子的其它多价产品,产品必须最终释放离子银以成为一种有效的抗菌剂。银金属(Ag0)没有抗菌活动,必须进行氧化,以形成最终可以释放离子银的产品。这一系列研究中描述的银基技术是一种称为SelectSilverSR12(SSSR12)的配方,将银离子(Ag+)包在微微溶解的玻璃微粒内。SSSR12抗菌剂通过溶解机制从基于玻璃的无机矩阵缓慢释放银离子。当周围环境(体液、静脉注射液等)接触微粒时,矩阵缓慢溶解,从而释放银离子。表面释放银离子的速度缓慢,但是足以快到在基底上面和附近维持有效的浓度。
       在银离子离开经过SSSR12处理的材料表面时,会由于与相邻水成环境中存在的蛋白质、盐或其它基底发生非特定交互作用而不活跃(图2)。这类交互作用以各种形式的银离子释放技术出现。当未粘附的银离子到达微生物表面时,抗菌的作用机制开始。微生物细胞摄取银离子的机制有几种,包括将银离子扩散到细胞内以及使用通常传输基本离子的系统进行主动传输。虽然Ag+会采用非特定的方式粘附到细胞表面并造成细胞膜功能中断,但是,人们广泛认为,Ag+的抗菌特性依赖于与细胞内的现场交互作用。进入细胞之后,银离子开始中断微生物的重要功能。银离子的反应性高,随时准备粘附到含有硫、氧和氮的给电子体官能团上以及磷酸盐和氯化物等负电荷官能团上。银离子的主要分子目标驻留于细胞硫醇(-SH)官能团内,通常发现位于称为酶的重要蛋白质中。酶会变性,因为存在由于Ag+粘附而造成的构象变化。生成细胞能源时需要Ag+变性的许多酶。如果充分中断微生物细胞生成能源的能力,则微生物将快速死亡。
硅橡胶中抗菌剂的评估
       如果生物相容性试验的结果表明抗菌剂处理对于其用途安全,则其它关键方面是处理的有效性。基于银的处理的抗菌效力评估遵循始于确定经过处理的材料内部或上面的剂量的试验计划。对于热塑性塑料,用于确定银剂量的方法涉及将样品加热到极高温度,以挥发和烧毁所有有机材料,然后用酸溶解灰烬,以溶解和释放银离子。确定溶解溶液中银离子浓度的最常用方法是原子吸收光谱(AAS)或电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)。但是,众所周知,很难采用化学方法溶解硅橡胶。确定经过处理的硅橡胶中银含量的另一种方法是采用X射线荧光光谱法(XRF)。这种方法利用了银的唯一X光信号的优点。该方法生成“X射线量”方面的结果,只提供相对的银剂量。量化银的数量要求建立已知银浓度对比X射线量的一根标准曲线。知道已经达到材料中银抗菌剂的目标剂量之后,需要了解银释放的动力。必须从表面释放银且能够进入微生物的细胞,以达到最大效力。最常见的方式是,释放银的形式是银离子Ag+。一般来说,将经过处理的材料暴露于模仿最终应用的溶液。然后使用AAS或ICPOES测量洗提液中的银离子浓度。通常修改暴露场景,以符合预期体积与表面面积的比率以及成品医疗设备的暴露持续时间。例如,基于硅橡胶的导尿管会每天暴露于人工尿或盐水新鲜溶液,时间长达连续30天。这些试验可以帮助了解银基抗菌剂技术是否相容硅橡胶矩阵,是否有能力持续受控地释放银离子,以及硅橡胶是否加载足量的抗菌剂,以释放银离子达到预期的使用持续时间。
       最后筛查经过处理的材料抵抗微生物的效力。通常分级开展抗菌剂的效力试验。首先,将经过处理和未经处理的硅橡胶样品暴露于微生物24小时,并确定存活微生物细胞的降低量。如果最初筛查试验显示积极结果,则修改效力试验参数以更好模拟设备的预期使用条件以及相关目标微生物。在确定银释放动力时,效力方法涉及修改接触经过处理的材料的溶液、体积与表面面积比率以及接触的持续时间。在本文总述的研究中,检查了基于银的几个不同抗菌剂,以确定其用于医疗设备的LSR的处理性能。
实验
       采用各种方法制备LSR样品,包括混合抗菌剂与LSR元件或者通过第三种流量扩散添加抗菌剂。采用压缩或注射模注样品块或实际设备元件。
硅橡胶中银基抗菌剂剂量的确定
       使用X射线荧光光谱(XRF;ThermoNoranQuanXEC公司,型号:C10014)确定样品中不同元素的含量估计值。XRF分析产生以“单位”为术语的元素浓度;单位越高,元素的浓度越高。但是,单位依赖于样品几何形状的程度极大,因此很难比较不同几何形状或配置的样品的单位。在绘制图形和分析之前,要减除背景单位。
银释放动力
       在室温中将经过处理的样品暴露于盐水(0.85%NaCl)24小时并缓慢搅拌,以测量样品释放的生物药效利用银。使用5%的硝酸将提取物酸化并使用ICP-OES(PerkinElmer,型号:Optima4300DV)测量银的含量(ppb)。要清除杂质,在酸化和分析之前,使用0.2微米的过滤器过滤所有样品。
使用薄膜接触筛查法确定效力
       使用“薄膜接触法”评估抵抗细菌的效力,这是“ISO22916:塑料-塑料表面抗菌剂活动测量”的一种修改方法。将样品块置于经过消毒的培养皿内并用异丙醇擦拭,以便进行清洁。然后将样品暴露于悬浮在采用0.2%营养肉汤补充的0.85%NaCl(盐水)中的细菌(0.4毫升,每毫升105个细胞)。采用聚乙烯薄膜盖住细菌悬浮液,以将接种体扩散到样品表面并防止干燥。在37℃孵化24小时之后,用10毫升中和溶液清洗样品,以清除粘附的细胞和非活性残留银离子。使用基于微浓度测定板的“最可能数量”化验量化中和溶液中存活细胞的数量。将每个样品的细胞数量转换为对数单位后,基于从未经过处理的聚丙烯回收的细胞数量计算暴露于LSR之后细胞的对数降低数量(对数降低数量=对数(细胞/聚丙烯样品)-对数(细胞/LSR样品)。未经处理的聚丙烯用作内部对照样品,因为以前的许多试验已经表明这种材料在引起细胞数量增加或减少方面呈惰性。最大对数降低数量代表效力最高,可以采用特别的研究测量。使用克雷白氏肺炎杆菌ATCC(美国模式培养物集存库)#4352和金黄色葡萄球菌ATCC(美模式培养物集存库)#6538试验复制样品。
使用TTC琼脂化验确定效力
       使用上面所述的薄膜接触法评估抗菌的效力。将带有微生物的样品在37℃孵化22小时之后,从样品上取下接种体,将样品倒置放在采用0.01%三苯基氯化四氮唑(TTC)补充的胰蛋白大豆琼脂板上。TTC是一种无色化合物,采用主动呼吸细菌会还原为不能溶解的红色。将TTC集成于营养琼脂板内,然后将暴露于微生物的样品置于板的表面,可以根据琼脂表面存在的红色检测任何存活的细菌。孵化琼脂板24小时并观察粘附在材料表面的存活细胞形成的红色区域。
使用“顶部接触”化验确定效力
       使用简单的化验评估带有和不带SSSR12的体外设备的LSR元件的效力。分散103、104或105抵抗甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC(美国模式培养物集存库)#43300(MRSA)或克雷白氏肺炎杆菌ATCC(美国模式培养物集存库)#4352细胞之后,立即将元件尖部接触营养琼脂板的表面,以接种样品。然后将接种的样品置于消毒盘内,并将在潮湿条件下在30℃孵化24小时。孵化之后,使元件重复接触消毒营养琼脂板的表面(10次)。另外在37℃再孵化营养琼脂板24小时。如果存活细胞在暴露于LSR元件最初24小时暴露时期时存活并转移到琼脂表面,则细胞可以在琼脂表面的接触部位生长和形成群体。采用导致成功转移存活细胞的接触数量以及观察每一接触点的生长量表示结果。
       通过模注制备LSR样品块,以制备三种不同含量的SSSR12抗菌剂剂量。开展X射线荧光光谱试验,以确定水平样品块中银的含量。虽然这一特别研究中只有三个数据点,但是,在银含量和目标剂量之间存在密切的关系(R2=0.994)(图3)。另外还在压缩模注样品块上开展了这一研究,结果相似(未显示数据)。如果抗菌剂或抗菌剂载体含有相当独特的信号元素,还采用XRF检测其它抗菌剂。同时,XRF技术是一种无损技术,可以用于制造或品质保证实验室环境的在线测量。
12小时的时间使银离子达到平衡水平(本研究中为ca.500ppb)。缓慢释放银离子是通过多日使用保护表面所需要的释放动力的一部分。另外,银离子达到有效水平的时间框架符合形成生物膜需要的时间。
       采用两种不同剂量SSSR12处理的LSR通过重复暴露于盐水展示出缓释银离子(图5)。在单次暴露于盐水24小时之后,剂量反应较为明显。但是,在暴露于盐水两天之后,从两种样品中释放的离子似乎达到大约400ppb的平衡。至少连续七天暴露于新鲜盐水,释放的银维持在ca.400-450ppb。
在我们的实验室中已经观察到这种平衡现象多次,是由与相同溶液中存在的Ag、Cl和Na相关的共同离子效应造成的。这种平衡有效抑制了银的释放,直至银离子被清除(例如冲洗清除)或者粘附到细菌或其它有机物上面。解除平衡压力之后,再次释放银离子。并非所有银基抗菌剂都能展现采用SSSR12观察到的银释放动力。另一种银基技术已经用于LSR。将模注样品块暴露于盐水并采用前面所述的相同类型化验测量银的释放。结果表明最初释放的速率相对较高,之后在暴露于盐水两天之后急剧下降(图6)。暴露三天之后的释放速率变得稳定,但是释放的银离子浓度低(<30ppb)。进一步分析表明,LSR表面的大多数银微粒被一薄层硅橡胶盖住,降低了湿气到达银微粒的能力,因此释放银离子的浓度降低。使用相同方法评估的其它银基技术研究结果表明,大多数存在相同的问题。
       在暴露于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的代表种类24小时之后,评估了采用不同剂量的SSSR12处理的LSR的喷射模注样品块的抗菌性能。在暴露于盐水之前以及暴露于盐水3天和7天之后,试验了经过处理的LSR样品。本研究中,作为一种样品试验了未经处理的LSR。将在37℃暴露于未经处理的聚丙烯样品块24小时之后恢复的存活细胞数量与从未经处理和经过处理的LSR产品恢复的细胞数量进行比较。与未经处理的聚丙烯相比,暴露于未经处理的LSR的两种种类的数量微微降低(ca.0.6对数单位)。对于革兰氏阴性细菌克雷白氏肺炎杆菌,采用SSSR12处理的LSR的所有样品展示出最大的对数降低(经过处理的产品上没有恢复的存活细胞)。对于金黄色葡萄球菌,观察到明显的剂量反应,SR12的含量越高,则对数降低越高。观察了以前没有暴露于盐水的样品以及以前暴露于盐水3天和7天的样品的剂量反应。对于以前暴露于盐水的样品,在给定SSSR12剂量之内,效力保持恒定或微微增加。
       采用SSSR12处理的LSR展现了在重复暴露于盐水时抵抗两种微生物的持续效力,与动力研究中所看到的银缓释相符。虽然本研究中没有讨论这一主题,但是应注意到,银抵抗细菌比抵抗真菌更有效。同样,银离子很难渗透人体细胞的细胞壁和多细胞膜,银离子不能很好渗入真菌等更复杂微生物的细胞之内。可以使用足够的银处理医疗设备,以展示抵抗白假丝酵母菌等真菌的效力,但是,要求的剂量高于控制细菌生长的剂量。在后期固化采用5%和10%SSSR12抗菌剂处理的LSR之前和之后,对喷射模注样品块开展了相似研究。表明,与未经处理的聚丙烯相比,未经处理的LSR展示出微小但是一致的效力。在暴露于盐水之前以及暴露于盐水7天之后试验时,经过处理的LSR样品展示出抵抗两种试验微生物的效力更高。所有样品的对数降低量处于或接近最大值。在5%的剂量暴露于盐水7天之后,效力微微下降。后期固化对于抗菌性能没有可以测量的影响。需要开展可以确定暴露于经过处理的表面之后存活细胞的实际降低数量的化验,以量化抗菌效力。要求提供此类数据,以在美国和欧洲注册经过抗菌处理的医疗设备。但是,还有其它技术可以用于快速筛查许多样品以及提供可视的效力显示。使用了微生物学中用于检测主动呼吸细胞的一种常见染料(TTC)修改上面所述用于测量存活细胞对数降低的薄膜接触法。将未经处理的聚丙烯样品、未经处理的LSR样品以及采用1.5%和5%SSSR12抗菌剂处理的LSR样品在37℃暴露于克雷白氏肺炎杆菌细胞中24小时。暴露之后,将样品置于TTC琼脂板的表面。在37℃孵化另外24小时之后,由于琼脂板表面生长细菌而形成红色,因此可以观察到存活细胞(图7)。保留在未经处理的聚丙烯和LSR上的存活细胞展示出在TTC琼脂板上广泛生长。对比之下,在采用1.5%SSSR12处理的样品上只检测到少量存活细胞。在采用5%SR12处理的样品上没有检测到存活细胞。
       可以提供有意义数据的另一种化验结果以及效力的可视图形参见图8。采用10%SSSR12处理的LSR被模注进体外设备的硅树脂元件中。元件太小,不能开展前面所述的标准薄膜接触法试验,因此开发了一种新的方法。该方法测量接种元件可以将存活细胞传输到营养琼脂板上多少次(共10次)。在接种体水平(103细胞)较低时,在MRSA的存活细胞未传输到琼脂之前,未经处理的元件样品在十次中有七次接触琼脂表面。在接种体水平(104-105细胞)较高时,细胞至少通过10连续接触传输到琼脂表面。对于经过处理的LSR元件,成功传输到琼脂表面的次数更低。每次接触传输到琼脂板的细胞数量也似乎更少。这些数据表明,经过处理的元件表面的存活细胞比未经处理的元件表面的存活细胞少。在其它研究中观察到,抵抗克雷白氏肺炎杆菌的效力高于抵抗金黄色葡萄球菌的效力(附表)。另一种基于银的产品也展现出在抵抗克雷白氏肺炎杆菌方面效力极好,但是,在抵抗金黄色葡萄球菌的效力方面没有采用SSSR12处理的样品样品有效。接种体水平也影响经过处理的LSR的效力,因为在较低接种体水平时,出现的细菌转移更少。另外,还在以前暴露于盐水三天和七天的LSR元件上开展了这种化验。如前所述,采用SR12处理的LSR的效力似乎在材料暴露于盐水时增加。这些结果表明,SSSR12能够在医疗设备实际元件的预期使用时间展示出效力。要求开展进一步研究以了解通过较长时期暴露以及在不同环境条件下的抗菌性能水平。
       通过将抗菌剂集成于设备元件内部或涂层设备而采用抗菌素处理医疗设备,已经证实可以帮助降低与设备相关的感染,但是只是少数情况。存在使用可以展现出生物相容性要求水平和持续效力水平的现有成份开发新的抗菌剂或新技术的机会。由于存在这些要求,银基抗菌素仍然是集成于医疗设备内部或表面的最常见和最可靠的抗菌剂。